本文刊于：岭南心血管病杂志，,23(04):-
作者：王玲，常晓，徐慕娟，乔秋杰，韩钺
摘要目的
探讨姜黄素对糖尿病心肌病大鼠心肌保护作用以及对神经调节蛋白-1（neuregulin-1，NRG-1）/ErbB2信号通路的影响。
方法
将80只Wistar大鼠随机分为正常组（CN组）、模型组（M组）、姜黄素高剂量组（HC组）、姜黄素低剂量组（LC组）和人类重组NRG-1药物组（AD组），检测血清中生化指标以及心肌功能变化情况，蛋白免疫印迹法（westernblotting）检测NRG-1/ErbB2信号通路中蛋白表达情况，实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测Bax、Bcl-2基因表达情况。
结果
HC组空腹血糖（fastingblood-glucose，FPG）、三酰甘油（triglycerides，TG）、肌酸激酶同工酶-MB（creatinekinase-MB，CK-MB）、左心室舒张末内径（leftventricularenddiastolicdimension，LVEDD）、左心室收缩末内径（leftventricularendsystolicdimension，LVESD）及左心室后壁厚度（leftventricularposteriorwallthickness，LWPWT）均显著低于M组，差异有统计学意义（P0.05或P0.01）；而胰岛素（insulin，INS）、左心室射血分数(leftventricularejectionfraction，LVEF)、左心室短轴缩短率（leftventricularhigherfractionalshortening，LVFS）及心率（heartrate，HR）显著高于M组，差异有统计学意义（P0.01）。苏木素伊红染色和Masson染色显示，M组心肌组织中细胞排列紊乱，心肌纤维肥大、疏松，可见纤维空泡样变化，而AD组、HC组心肌细胞排列整齐，心肌间质未见异常改变。TUNEL检测结果显示，M组凋亡指数（apoptoticindex，AI）显著高于CN组，差异有统计学意义（P0.05）；而AD组、LC组及HC组AI显著高于M组，差异有统计学意义（P0.05）。Westernblotting结果显示，LC组及HC组NRG-1、p-ErbB2蛋白相对表达量均显著高于M组，差异有统计学意义（P0.05）；而转化生长因子β1（TGF-β1）蛋白相对表达量显著低于M组，差异有统计学意义（P0.05）。逆转录-聚合酶链反应检测结果显示，HC组Bax基因相对表达量显著高于M组，而Bcl-2基因相对表达量显著低于M组，差异均有统计学意义（P0.05）。
结论
姜黄素对糖尿病心肌病大鼠模型具有心肌保护以及抑制心肌组织纤维化作用，这一作用机制可能与激活NRG-1/ErbB信号转导通路有关。
糖尿病心肌病是糖尿病患者的主要心脏并发症之一，发病率高、危害性大，与糖尿病患者心血管疾病的高发生率和高病死率密切相关。其原因是由于高血糖引起的由多种炎症介质参与的心肌代谢紊乱，进而引起心肌肥大和纤维化，早期通常表现为心肌顺应性降低和舒张期充盈受限为主的舒张功能不全，晚期以收缩功能不全为主，易发生充血性心力衰竭[1]。如何改善心肌纤维化，减少心肌细胞凋亡，是现阶段预防和治疗糖尿病心肌病的主要靶点和手段。目前已经有报道证实，姜黄素对糖尿病心肌病大鼠具有心肌保护以及抑制心肌纤维化的作用[2]。ErbB受体家族中ErbB2、ErbB4受体是成年人心脏中神经调节蛋白-1（neuregulin-1，NRG-1）的受体。有研究发现，敲除ErbB2基因的小鼠出现扩张型心肌病的改变，同时ErbB2、ErbB4受体mRNA及蛋白表达水平显著下降[3]。研究证实，NRG-1/ErbB2信号通路可以促进心肌细胞增殖、减少其凋亡，促进血管新生、抑制平滑肌过度增生导致的血管狭窄等[4]。但目前对于姜黄素对心肌细胞抗纤维化以及心肌保护作用机制的研究尚不统一，尤其是对NRG-1/ErbB2转导通路及其下游因子的影响研究报道较少。本研究旨在探讨姜黄素对糖尿病心肌病大鼠心肌保护以及抗纤维化作用及其机制研究，以期为糖尿病心肌病的治疗以及临床新药研究和开发利用提供一定的理论参考依据。
1资料和方法
1.1动物模型及分组
80只Wistar雄性大鼠（生产许可证：SCXK--），清洁级，体质量~g，购自广州中医药大学。适应性喂养1周，相对湿度控制在50%左右，室温在25℃左右，光照时间在12h，每隔1d换垫料一次，保持饲养笼干燥。按随机数字表法随机分为5组，每组16只：正常组（CN组）、模型组（M组）、姜黄素高剂量组（HC组）、姜黄素低剂量组（LC组）和人类重组NRG-1药物组（AD组）。
1.2实验仪器与主要试剂
主要实验仪器：血糖测试仪（长沙三诺生物传感技术有限公司）、AU全自动生化分析仪（OLYPUS公司，日本）、彩色超声诊断仪（GE公司，美国）、YB-6LF组织石蜡切片机（孝感亚光医用电子技术有限公司）、垂直电泳槽、转移电泳槽（BIO-RAD有限公司，美国），ABI实时荧光定量聚合酶链反应（quantitativereal-timepolymerasechainreaction，QRT-PCR）仪、Hema基因扩增仪（美国应用生物系统公司），芬兰热电雷勃MK3酶标仪（Thermo公司，美国），ThermoStratos低温离心机（ThermoStratos公司，美国），光学显微镜（OLYPUS公司，日本）。
主要试剂：4%多聚甲醛（临沂瑞银化工有限公司），3%戊巴比妥钠（上海哈灵生物试剂检测中心），Masson三色染色试剂（上海歌凡生物科技有限公司），TUNEL试剂盒（罗氏公司，美国），NRG-1、TGF-β1及ErbB2单克隆抗体（CellSignalingTechnolgy公司，美国），p-ErbB2（SantaCruz公司，美国），Trizol试剂盒（Invitrogen公司，美国），RNA酶抑制剂（普洛麦格公司，美国）。
1.3药物配制
姜黄素为中药姜黄的根茎中提取得到的黄色色素（购于美国Sigma公司）。采用万分之一天平称取姜黄素粉末溶于二甲亚砜（DMSO）中，配成3mg/mL的原液并置于-20℃冰箱中保存备用。采用二甲亚砜培养基稀释部分原液，配成实验所需浓度，二甲亚砜的终剂量小于0.1%。
1.4动物模型的建立及给药方法
CN组喂以标准大鼠饲料，M组及各药物干预组喂高糖高脂（含20%蔗糖和10%猪油）的饲料；大鼠自由饮水。每日晨晚时间各为12h，室温保持在22℃～25℃，湿度在50%左右。4周后模型组及各药物组大鼠采静脉血进行空腹（禁食10~12h，其间自由饮水）血糖、胰岛素浓度测定，后给予一次性腹腔注射链脲佐菌素（streptozoticin，STZ，40mg/kg），CN组大鼠给予同等剂量柠檬酸钠缓冲液腹腔注射。M组及各药物干预组连续注射1周，于注射后的后的第3、7、14天通过尾静脉取血测定各组大鼠的随机血糖，注射STZ第14天后随机血糖仍高于16.7mmol/L，可以作为糖尿病心肌病大鼠的入选条件。各组大鼠以原饲料继续喂养12周，同时给予HC组姜黄素30mg/kg、LC组姜黄组15mg/kg灌胃，每天1次；AD组给予rhNRG-mg/kg，隔日1次；CN组与M组予以等量0.9%氯化钠溶液灌胃。各组大鼠于药物治疗或0.9%氯化钠溶液灌胃12周后收集血清及组织标本。
1.5血清生化指标检测
试验给药结束后所有大鼠均禁食12h，断尾取血，采用低温离心机以r/min离心获得血清，采用全自动化分析仪检测血清中空腹血糖（fastingblood-glucose，FPG），胰岛素（insulin，INS），总胆固醇（totalcholesterol，TC），三酰甘油（triglycerides，TG），肌酸激酶同工酶-MB（creatinekinase-MB，CK-MB）浓度。
1.6病理观察
给药结束行心脏超声检测后，断颈处死各组大鼠。用组织剪开皮肤，钝性分离皮下组织。用镊子夹住胸骨剑突，剪断膈肌与胸骨的连结，打开胸腔小心剪开心包膜后，暴露心脏。结扎大血管根部后，迅速取出心脏。用冷等渗盐水洗净血液，滤纸吸干后，用电子天平称取并记录心脏质量(mg)，计算心脏质量/体质量(mg/g)；小心分离出左心室后，取一部分左心室组织，编号后用4%多聚甲醛固定，备用于苏木素-伊红染色（HE染色）、Masson染色。另一部分左心室心肌组织编号后立即置入-80℃液氮中保存，备用于QRT-PCR和western-blotting的检测。
1.7超声心动图观察心脏受损程度
给药结束后，用3%戊巴比妥麻醉大鼠，大鼠仰卧位固定，褪去前胸部毛发，采用心脏实时三维超声诊断仪盲法检测大鼠心功能。于左胸取左心室长轴的切面，观察的指标包括大鼠左心室舒张末内径（leftventricularenddiastolicdimension，LVEDD）、左心室收缩末内径（leftventricularendsystolicdimension，LVESD）、左心室后壁厚度（leftventricularposteriorwallthickness，LWPWT）、左心室射血分数（leftventricularejectionfraction，LVEF）、左心室短轴缩短率（leftventricularhigherfractionalshortening，LVFS）及心率（heartrate，HR）。每只大鼠至少观察3个连续的心动周期，然后取平均值。
1.8细胞凋亡检测
采用末端脱氧核糖核苷酰转移酶介导的标记脱氧脲核苷酸缺口末端标记法（TUNEL）检测心肌凋亡细胞，按照TUNEL试剂盒说明书逐步添加试剂，光学显微镜下观察、拍照，每张切片均在倍镜下随机取5个视野，计算凋亡指数（apoptoticindex，AI），每个细胞核中所含凋亡细胞数，AI=凋亡细胞数/总细胞数×%，求其均值。
1.9Westernblotting检测NRG-1/ErbB2-TGF-β1通路蛋白表达
检测的蛋白主要有NRG-1、ErbB2、p-ErbB2及转化生长因子β1（transforminggrowthfactor-β，TGF-β1）。取实验各组左心室组织mg，加入μL细胞裂解液和蛋白酶水解抑制剂（PMSF）后充分匀浆，将液体吸出置于冰上裂解45min，低温离心机以10r/min离心25min，取上清液，采用考马斯亮蓝法进行总蛋白质定量。蛋白质样品与1/4倍量的5′SDS上样缓冲液混合均匀（体积比为1：5），水浴煮沸7~8min，采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）制胶，在V电压，恒定电流mA下进行电泳2h，湿转至硝酸纤维膜上，以5%的脱脂奶粉TBST缓冲液4℃封闭过夜，加入一抗（即鼠抗人NRG-1、ErbB2、p-ErbB2及TGF-β1)。TBST洗膜3次后，与结合有辣根过氧化物酶标记的二抗（山羊抗小鼠IgG，体积比为1:）室温孵育1h，TBS洗膜3次后，采用化学发光试剂盒（ECL）进行显显色，X胶片进行曝光显影。各组动物肺组织中NRG-1、ErbB2、p-ErbB2及TGF-β1蛋白含量测定依据胶片扫描所得灰度值并且通过与β-actin进行比较所得的灰度值比。
1.10RT-PCR检测组织中Bax及Bcl-2基因的表达
采用Trizol试剂盒提取各组大鼠胸主动脉组织总RNA并进行逆转录，采用PCR扩增Bax及Bcl-2基因，且扩增β-actin作为内参。逆转录配置反应体系为：无RNA酶双蒸水14.5μL，0.5μLRNas抑制剂，逆转录酶1μL，然后将RT引物（2μL）、总的RNAng以及Buffer（5μL）加入到该反应体系中，在46℃45min，94℃5min体系中行逆转录反应，另取逆转录产物上游及下游引物各1μL，2×MasterMix12μL，补充双蒸水至25μL。采用95℃预变性5min，94℃变性25s，56℃退火30s，70℃延伸30s，75℃变形25s，56℃退火25s,70℃延伸40s，75℃变性25s，55℃退火25s，70℃延伸40s，如此重复35个循环，73℃后延伸5min。RT引物及PCR引物见表1。记录各个反应管中发出荧光信号强度值（CT值），将所得原始数据通过3次以上重复扫描获得平均值，以β-actin的光密度值作为参照，以组织中各基因光密度值与其对比所得相对值（2-??Ct表示）为准。
1.11统计学分析
采用SPSS19.0统计软件包对所得数据进行分析以及ImageJ4.2对图片进行扫描处理。正态计量资料采用（均数±标准差）表示，组内两两比较用Bonferroni’sposttest检验，组间比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA）。计数资料以[n(%)]表示，采用χ2检验。基因检测结果采用2-??Ct表示，并经对数转换后进行Ks检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1各组大鼠血清生化指标检测结果
研究结果显示，M组FPG、TG以及CK-MB浓度均显著高于CN组，差异有统计学意义（P0.05或P0.01）；而INS浓度显著低于CN组，差异有统计学意义（P0.01）。AD组、HC组FPG、TG以及CK-MB浓度均显著低于M组，差异有统计学意义（P0.05或P0.01）；而INS浓度显著高于M组，差异有统计学意义（P0.01）。HC组与AD组上述各生化指标之间比较，差异无统计学意义（P0.05）。各组大鼠血清生化指标检测结果比较，详见表2。
2.2各组标本苏木素伊红染色结果比较
苏木素伊红染色结果显示，CN组心肌组织结构层次明显，心肌纤维呈均匀分布，未见到炎症细胞以及心肌组织纤维化（图1A）。M组心肌组织中细胞排列紊乱，心肌纤维肥大、疏松，可见纤维空泡样变化（图1B）。AD组心肌纤维组织排列较整齐，细胞核较清晰，心肌间质未见异常改变（图1C）。LC组仍可见部分心肌纤维排列紊乱、部分纤维细胞出现空泡样改变（图1D）。HC组心肌纤维组织排列较为整齐，但仍可见部分心肌纤维空泡样改变（图1E）。
2.3各组Masson染色结果比较
Masson三色结果显示，心肌纤维细胞染成暗红色，间质胶原染成蓝色。CN组间质胶原组织均匀分布，形成完整的胶原纤维网（图2A）。M组间质胶原蓝染明显多于CN组，且心肌纤维细胞出现肥大、疏松，排列不整齐，周围血管纤维化显著（图2B）。AD组间质胶原组织分布均匀，偶见间质胶原蓝染（图2C）。LC组胶原组织蓝染部分较多，组织纤维化明显，但心肌纤维组织较M组排列整齐（图2D）。HC组胶原组织蓝染部分较M组、LC组明显较少，纤维化明显减少（图2E）。
2.4各组超声心动图检测指标比较
超声心动图检测结果显示，M组LVEDD、LVESD及LWPWT均显著高于CN组（P0.05），而LVEF、LVFS及HR均显著低于CN组（P0.05）；AD组、HC组LVEDD、LVESD及LWPWT均显著低于M组（P0.05），而LVEF、LVFS及HR均显著高于M组（P0.05），差异均有统计学意义。AD组与HC组在上述各指标之间比较，差异无统计学意义（P0.05）。各组超声心动图检测指标比较，详见表3。
2.5TUNEL试剂盒检测细胞凋亡情况
TUNEL试剂盒检测结果显示，M组大量心肌细胞出现固缩、凋亡；AD组、LC组及HC组心肌凋亡细胞明显减少。通过定量分析显示，M组AI显著高于CN组（P0.05），AD组、LC组及HC组AI显著高于M组（P0.05），差异有统计学意义，见图3。
2.6Westernblotting检测NRG-1/ErbB2-TGF-β1通路蛋白表达情况
Westernblotting检测结果显示，M组NRG-1、p-ErbB2蛋白相对表达量均显著低于CN组，而TGF-β1蛋白相对表达量显著高于CN组，差异均有统计学意义（P0.05）。AD组、LC组及HC组NRG-1、p-ErbB2蛋白相对表达量均显著高于M组，而TGF-β1蛋白相对表达量显著低于M组，差异均有统计学意义（P0.05）。AD组NRG-1相对表达量高于LC组、HC组，差异均有统计学意义（P0.05）。三组之间p-ErbB2、TGF-β1相对量比较，差异无统计学意义（P0.05）。Westernblotting检测NRG-1/ErbB2-TGF-β1通路蛋白表达结果见图4。
2.7RT-PCR检测Bax、Bcl-2基因表达情况
RT-PCR检测结果显示，M组Bax基因相对表达量显著低于CN组，而Bcl-2基因相对表达量显著高于CN组，差异有统计学意义（P0.05）。AD组、HC组Bax基因相对表达量显著高于M组，而Bcl-2基因相对表达量显著低于M组，差异有统计学意义（P0.05）。AD组Bax基因相对表达量显著高于LC组、HC组，差异有统计学意义（P0.05）。RT-PCR检测Bax、Bcl-2基因表达情况详见图5。
3讨论
糖尿病心肌病是一种独立于冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）、原发性高血压（高血压）或者其他风险性因子，其由糖尿病引起的一种特异性心肌病，临床上主要表现为左心室舒缩功能障碍以及左心室肥厚等，随着疾病的发展，晚期患者主要表现为心肌收缩功能不全[5]。研究表明，糖尿病患者心肌细胞内葡萄糖转运蛋白4的活性降低导致心肌细胞对葡萄糖的转化利用障碍，同时高血糖直接对心肌造成损伤，加重这一障碍作用[6]；而胰岛素抵抗导致循环中游离的脂肪酸增加，心肌细胞对脂肪酸的吸收以及氧化增多，导致心脏出现易感性缺血，同时心肌细胞通过介导线粒体中脂肪酸β氧化酶的表达，使大量脂肪酸进入线粒体后，促使过量脂肪酸向TG转化，导致TG堆积[7]。通过本研究显示，M组大鼠FPG、TG浓度显著高于CN组，而INS浓度显著低于CN组，提示糖尿病心肌病大鼠存在明显的血糖血脂代谢紊乱。
姜黄素是从中药姜黄中提取的酚性活性单体，其药理作用较为广泛，具有抗氧化、抗炎、抑制肿瘤细胞、抗纤维化等作用。目前，已经有报道指出，姜黄素可以通过上调miRNA-a的表达，同时抑制NF-kB的激活，从而达到改善心肌纤维化的作用[8]。本研究通过苏木素伊红染色以及Masson染色显示，糖尿病心肌病模型组大鼠心肌细胞排列紊乱、心肌纤维细胞出现肥大、疏松，排列不整齐，而姜黄素高、低剂量组心肌细胞排列较为整齐，间质胶原组织分布均匀。进一步采用TUNEL试剂盒检测发现，糖尿病心肌病模型大鼠心肌细胞出现大量固缩、凋亡，而姜黄素高、低剂量组心肌细胞凋亡细胞明显减少，提示，姜黄素可能通过抑制心肌细胞纤维化从而达到保护心肌细胞的作用。
NGR-1作为心肌细胞调节和保护性生长因子，可以调控神经胶质细胞，上皮细胞，神经元和心肌细胞的生长发育，同时激活ErbBs蛋白的受体酪氨酸激酶（表皮生长因子受体的经典成员）进行一系列的信号转导[9]。NRG-1/ErbB信号通路在神经发育，细胞增殖分化等生命过程中发挥着重要作用，与心力衰竭，心肌梗死等疾病的发生、发展密切相关。NRG-1/ErbB信号转导系统的下游信号转导通路包括细胞外信号调节激酶（ERK）的活化、磷脂酰肌醇-3（phosphoinositide-3Kinase，PI3K）/抗凋亡激酶（AKT）信号转导通路的活化、分裂原活化蛋白激酶（MAPK）活化及Src/Fak信号转导通路的激活[10]。需要指出的是，目前对于姜黄素对糖尿病心肌病大鼠模型心肌细胞的保护作用及其机制的研究较少，尤其是对NRG-1/ErbB2信号通路及其下游因子的影响研究报道较少。本研究westernblotting结果显示，糖尿病心肌病模型大鼠NRG-1、p-ErbB2蛋白相对表达量显著低于对照组，而姜黄素高、低剂量组能显著提高NRG-1、p-ErbB2蛋白表达，与模型组比较差异有统计学意义（P0.05），提示姜黄素可能通过激活NRG-1/ErbB2信号通路达到抑制糖尿病心肌病大鼠模型心肌纤维化的作用。
糖尿病心肌病患者ErbB2受体的表达及磷酸化能够引起抗凋亡激酶活性的增加，抑制细胞凋亡，同时也可以降低凋亡基因Bcl以及上调抗凋亡基因Bax基因的表达。黄鑫等[11]实验证实应用NRG-1后心肌细胞凋亡减轻，其作用推测是通过上调Bcl-2、下降Bax而产生的。与凋亡相关Bax和Bcl-2蛋白表达的改变可能与NRG与ErbB受体结合引起PI3K/AKT信号活化有关。分裂原活化蛋白激酶及信号转导蛋白和转录激活因子（Stat）的激活促使了一系列转录激活因子的活化[12]。心肌纤维化是糖尿病心肌病特征性病理表现，最终将导致心室舒缩功能不全。在糖尿病心肌病合并心力衰竭或长期高血糖的刺激下，心肌细胞NRG-1/ErbB信号系统是受损的，此时心脏迷走神经被抑制、交感神经相对较兴奋，于是心力衰竭的危险性增加，肾素-血管紧张素-醛固酮系统被激活，直接反映为血管紧张素Ⅱ、TGF-β1表达上调，从而促进心肌纤维化的进行[13]。除了影响心脏自主神经外，NRG-1激活ErbB受体后，可提高心脏内皮一氧化氮合酶的活性，而一氧化氮合酶活性升高，可降低交感神经活性，抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活，减血管紧张素Ⅱ的表达，减少成纤维细胞的增生以及胶原的合成，从而减少心肌纤维化的程度[14]。因此，NRG-1/ErbB信号转导通路对于心脏的结构及心功能维护有重要的作用。通过RT-PCR显示，糖尿病心肌病模型大鼠Bax基因相对表达量显著低于对照组，而Bcl-2基因相对表达量显著高于对照组；姜黄素高剂量组Bax基因相对表达量显著高于糖尿病心肌病模型组，而Bcl-2基因相对表达量显著低于糖尿病心肌病模型组。提示姜黄素可能对糖尿病心肌病大鼠模型心肌细胞具有保护作用，其作用机制可能与激活NRG-1/ErbB信号转导通路，刺激下游Bax/Bcl-2相关基因蛋白的表达，从而抑制心肌细胞凋亡。
TGF-β1是目前已经公认的诱发心肌纤维化的重要因子。研究显示，糖尿病心肌病大鼠12周左心室心肌组织内TGF-β1mRNA和蛋白呈高表达[15]；另有研究发现，姜黄素类似物能够抑制糖尿病心肌病大鼠TGF-β1的表达[16]。本研究结果显示，姜黄素还可以通过NRG-1/ErbB信号转导通路抑制TGF-β1表达，从而达到抑制心肌组织纤维化的作用。
综上，姜黄素对糖尿病心肌病大鼠心肌细胞具有保护作用，这一作用机制可能与激活NRG-1/ErbB信号转导通路及下游Bax/Bcl-2因子，从而达到抑制心肌组织纤维化作用。
参考文献（略）
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