大家好，今天为大家分享一篇年11月发表在《Autophagy》上的一篇文章Ahigh-throughputscreeningidentifiesZNFasanovelregulatoroftheubiquitin-proteasomesystemandautophagy-lysosomalpathway文章的通讯作者是来自汉堡大学医学中心实验药理学和毒理学系的LucieCarrier；她主要的研究方向是肥大心肌病，收缩蛋白与新功能和基因治疗。
摘要：
泛素-蛋白酶体系统(UPS)和自噬-溶酶体途径(ALP)是真核细胞中两条主要的蛋白质降解途径。以前认为UPS和ALP是两条独立的通路，最近的研究证明它们是可以协同作用的。由于UPS和ALP功能的改变可能导致神经退行性疾病、癌症和心脏病，所以对寻找调节这些分解代谢过程的靶点引起了研究员的兴趣。作者为了确定能够同时调节UPS和ALP的效应器，而进行了一项具有参考意义的全基因组高通量筛选。作者建立了一个稳定表达UPS报告基因(UbG67V-mCherry)和ALP报告基因(GFP-LC3)的HEK细胞系，并通过基因敲除后筛选了使UbG67V-mCherry强度增加和GFP-LC3斑点的基因。通过严格的筛选，作者分离出了80个候选基因，其中包括转录因子ZNF(啮齿动物中的ZFP)。在对HEK细胞中Zfp过表达的筛选验证后，作者评估了Zfp在新生大鼠心室肌细胞(NRVMs)中的基因的下调和过表达。内源性的ZFP和高表达的ZFP能够定位在细胞核。接下来的实验证明，ZFP对NRVMs的UPS有负调节作用，对ALP活性有正调节作用。对敲除Zfp基因的大鼠进行了RNA-sep，结果显示，基因敲除后的许多泛素化和去泛素化酶的基因表达发生了变化，自噬激活剂和启动子的表达减少，自噬抑制物的表达量增加。作者发现ZPF激活了参与自噬过程的Dapk2和Fycol的启动子。Zfp基因敲除后的RNA-seq还显示了与心脏发育和/或肥大有关的几个基因的积累。综上所述，作者的研究为ZNF激活ALP、抑制UPS和调控与心肌细胞结构/功能相关的基因提供了证据。
引言
泛素-蛋白酶体系统(UPS)和自噬溶酶体途径(ALP)是真核细胞中两个主要的蛋白降解途径，对维持细胞内环境的稳定起着重要作用。UPS依赖于高度保守的小分子泛素，这种泛素以能量依赖的方式被标记为目标底物上的赖氨酸残基的链。这种泛素链的形成涉及三种酶的作用：E1泛素激活酶，E2泛素结合酶，和特定的E3泛素连接酶。泛素链可以被蛋白酶体识别，以ATP依赖的方式降解靶底物。ALP包括微自噬、巨自噬和伴侣介导的自噬三种途径。在这篇文章中，作者研究的是巨自噬/自噬(以下简称ALP)，它涉及到一个瞬间的双膜结构，即吞噬载体。然后吞噬目标底物，如蛋白质、蛋白质聚集体、核酸和完整或碎裂的细胞器。吞噬载体的扩张和完成会产生一个自噬小体，然后与溶酶体融合形成自溶酶体，以降解其内容物。当这UPS，ALP系统中的一个或两个出现故障时，可能会导致一些疾病的发生。神经退行性疾病（如：阿尔兹海默症、帕金森）、癌症、传染病或免疫性疾病（如：微生物感染）、肌肉疾病（如：庞贝病）和心脏疾病（如：DES相关的心肌病）都与这两个蛋白降解系统的缺陷有关。
传统上，大家都认为这两条通路是单独起作用的，但最近人们观察到这两条通路存在共同的效应器，也就是说这两条通路可能存在直接作用。为了确定同时影响UPS和ALP的新蛋白，作者设计了一种基于荧光的高通量细胞筛选(HTS)，利用慢病毒编码的短发夹(Sh)RNA在全基因组范围内敲除基因，并对其在新生大鼠心室肌细胞(NRVMs)中的命中结果进行了评估。
讨论
UPS和/或ALP的破坏或激活，会使细胞内环境中蛋白质的降解增加或减少，从而可能导致疾病病理或发病率增加。例如，许多迟发性神经退行性疾病，如阿尔兹海默症、帕金森病和亨氏顿病中的UPS和ALP系统都出现了故障。此外，通过蛋白质降解途径治疗疾病的潜在临床重要性使UPS和ALP成为临床肿瘤学中治疗干预的重点研究内容，其策略是通过抑制UPS活性并抑制或激活ALP活性而实现治疗作用的。
许多遗传性心肌病，例如Danon病，Vici综合征，豹皮综合征，扩张型心肌病，DES相关性心肌病和左心室致密化不全，这些疾病都与UPS和/或ALP的失调相关。作者研究了肥厚性心肌患者和心肌MYBPC3(肌球蛋白结合蛋白C3)突变小鼠中UPS和ALP的改变，发现通过抑制UPS或激活ALP可以改善小鼠的心肌疾病。在其他的心脏疾病模型中，也发现了通过激活UPS或抑制ALP也能使相应的疾病得到改善。总而言之，UPS和ALP在许多疾病中都具有明显的疾病修正作用，但对于每一类疾病，都必须确定其需要哪种调节方式以发挥其疾病修正作用，目前的研究仍然缺乏许多合适的靶点和/或药物。因此，需要通过更多的科学发现来鉴定未被识别的蛋白，这些蛋白的作用可以抑制或激活UPS,ALP途径。
HTS是寻找影响细胞过程中的新蛋白的一种有效的方法。鉴于UPS的报告基因能够与修饰泛素或降解子序列的荧光基团结合，然后鉴定ALP、LC3的存在，作者为了验证这两个系统的共同调节器而开发了一种基于细胞的自动筛选实验。作者使用HEK细胞，因为它们生长状况良好，能够高效率、稳定的进行转染，还能为筛选实验提供了高度重复性的底物。UPS和ALP都是高度保守的信号转导通路，因此作者推测之前的实验处理对其他类型的细胞也是有效的。随后利用心肌细胞进行的实验部分证实了这一推测。
在初始筛选中鉴定出多个独立的ZNFshRNA克隆。虽然筛选的目的是在HEK细胞中发现其UbG76V-mCherry(=UPS抑制)和GFP-LC3(=ALP抑制)同时被敲除的基因，但随后的Zfp在NRVMs中的敲除或过表达实验并没有得到完全相同的结果。事实上，作者发现ZFP激活了自噬，但抑制了UPS途径。同样的，作者发现在另外两个HTS实验中发现，COPB1和VPS28也激活了自噬抑制了NRVMs的UPS途径。作者不能排除UbG76V-mCherry在HEK细胞中的积累是自噬抑制的结果，因为先前有数据表明，通过几种方法抑制自噬会损害HeLa细胞中蛋白酶体的降解。与分化的心肌细胞相比，在筛选中使用的细胞对蛋白水解系统的调节也可能有所不同。作者还发现了Zfp在CRYABRG小鼠蛋白毒性模型中上调的结果，这可能是一种补偿作用，并表明Zfp的敲除(如JAK1)减少了CRYABRG诱导的NRVMs中的聚集，能够激活UPS，但不能抑制ALP。尽管这与预想的结果相反，但研究表明只要激活两种蛋白降解系统中的其中一种就能清除聚集体。作者不能排除ALP的激活是ZNF抑制UPS的次要反应。虽然ZNF激活了Dapk2和Fyco1启动子，其产物与自噬激活有关，但这种激活仍然可能是一种间接影响，例如，蛋白酶体抑制已被证明通过激活转录因子EB来激活几个ALP基因的表达。记载的有关ZNF功能的资料很少，其中有一个是在急性心脏病中ZNF可以保护心脏。ZNF(啮齿动物中的ZFP)是在人类胚胎心脏cDNA文库中发现的，好像与进化保守的锌指蛋白家族有关，包含一个调节KRAB-A和17个串联的C2H2型锌指结构域。在报告系统中，COS-7细胞中过表达的ZNF表现出核定位和抑制荧光素酶活性的功能。作者证实了内源性和过表达的ZFP在NRVMs中的核定位作用。有趣的是，在心肌肥厚的小鼠模型中，DCM或HCM患者的心脏中ZNF蛋白水平表达量显著降低，而在小鼠模型或原代心肌细胞中ZNF的过表达可以保护小鼠的心肌肥厚，并改善小鼠主动脉缩窄后的功能丧失。尽管作者在小鼠和人的肥厚心肌和扩张型心肌标本中没有检测到ZNF的mRNA水平与对照组有任何差异，但作者对siZfp处理的NRVMs进行的RNA-seq分析支持之前的研究结果，即ZNF对心肌细胞肥大和心力衰竭具有保护作用。另一个研究小组报道，在食道鳞癌患者中存在DNA高甲基化和ZNF的表达下调，而ZNF的低表达与胃癌患者的不良预后相关，表明ZNF在人类疾病中起作用。但是，这些数据并没有将ZNF与UPS和ALP相关基因的调控联系起来。作者的数据说明了ZNF对UPS和ALP功能的影响，也可以解释ZNF对心脏肥厚和癌症的积极作用，因为对治疗这两种疾病来说，抑制UPS活性和上调ALP活性都是有益的。但是，必须谨慎对待这些数据，因为其他研究表明，在小鼠心肌缺血/再灌注损伤或压力超负荷后，基于基因的蛋白酶体活性增强具有心脏保护作用或抑制心肌蛋白酶体对心脏有害，更重要的是，蛋白酶体抑制剂（如硼替佐米或卡非佐米），可导致多发性骨髓瘤患者的心脏中毒。
综上所述，UPS和ALP系统在几种疾病中有重要意义，作者认为这两条途径存在靶向治疗的重要潜力。该研究中，作者分离出可调节HEK细胞中UPS和ALP活性的候选基因，并将这些基因应用到了NRVMs中，验证了该筛选过程在不同细胞类型和组织中的潜在可应用作用。
Singh,S.,M.Meyer-Jens,E.Alizoti,W.Bacon,G.Davis,H.Osinska,J.Gulick,S.Reischmann-Düsener,E.Orthey,P.McLendon,J.Molkentin,S.Schlossarek,J.RobbinsandL.J.A.Carrier()."Ahigh-throughputscreeningidentifiesZNFasanovelregulatoroftheubiquitin-proteasomesystemandautophagy-lysosomalpathway."
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