文章导读
iPS技术是干细胞研究领域的一项重大突破，iPSC常被用于建立疾病模型、研究基因/疾病分子机制、药物筛选，治疗等方向研究。今天和大家分享的一篇文章，作者建立疾病模型，研究治病机制，使用CRISPR/Cas9基因编辑技术证明TNNT2R92W突变的致病性，以及药物治疗作用机制研究。
期刊：EurHeartJIF：19.doi:10./eurheartj/ehz32
引言
肥厚型心肌病(Hypertrophiccardiomyopathy，HCM)的特征为心室壁异常增厚、心律失常、猝死和心力衰竭风险增加。舒张期功能障碍(DD)在肥厚型心肌病(HCM)患者中很常见，如果不进行治疗，DD可发展为心力衰竭，从而导致死亡率。然而，DD在HCM中的细胞机制尚不十分清楚，这极大地阻碍了特异性有效疗法的开发。患者特异性诱导多能干细胞衍生的心肌细胞(iPSC-CMs)蕴藏着巨大的潜力，有助于研究HCM中DD的潜在机制，并作为药物发现的平台。
研究框架
本研究建立了DD的诱导多能干细胞衍生的心肌细胞(iPSC-CM)模型，该模型携带家族性HCM中三种最常涉及的肌节蛋白突变。并证实了这些舒张期功能障碍的iPSC-CM模型具有单细胞水平的舒张功能受损。基于不同的功能分析，作者证明了舒张期Ca2+处理会增加HCMiPSC-CMs的肌丝Ca2+敏感性，揭示了使用iPSC-CMs的DD的新的细胞机制和潜在的治疗靶点。干扰[Ca2+]i稳态加重HCMiPSC-CMs的舒张期功能障碍，并研究了ICa、INaL和CaMKII抑制剂潜在治疗干预的窗口，这可能帮助心肌细胞在长期肾上腺素刺激下恢复舒张功能，并防止细胞凋亡。这项研究增加了我们对舒张期功能障碍发病机制和现有药物有效治疗作用机制的认识。而且，iPSC-CM模型为肥厚型心肌病中的舒张期功能障碍特殊突变机制研究和药筛选提供合适的平台。
研究结果
1、携带肥厚型心肌病突变的诱导多能干细胞分化心肌细胞（HCMiPSC-CM）表现出舒张功能障碍
6名家族性舒张功能障碍(DD)的HCM突变携带者（MYH7RH(n=2)、MYBPC3VM(n=1)、MYBPC3VL(n=1)和TNNT2R92W(n=2)突变）、1例无DD表型的HCM患者，该患者携带MYBPC3突变(c.ga)、无HCM突变的健康个体(n=2)用作野生型对照。分离各组外周血单个核细胞，重编程为iPSCs。再诱导分化为心肌细胞iPSC-CMs。
所有HCMiPSC-CM组的舒张期肌节长度较短，最大松弛肌节长度不变，松弛速度较慢，标准化松弛持续时间延长。这些结果表明，iPSC-CM模型在单细胞水平表现出独特的DD表型。
图1HCMiPSC-CM表现出舒张功能障碍
2、Ca2+处理肥厚型心肌病和舒张功能障碍的IPSc-CMs
考虑到Ca2+在调节心脏兴奋收缩偶联中的中心作用，研究员试图通过检测HCM组和对照组的iPSC-CMs中的Ca2+处理与Fura-2成像来解释舒张功能障碍的机制。结果表明HCMiPSC-CMs中Na+/Ca2+交换功能降低。临床上没有DD的HCM患者的iPSC-CMs，其舒张期Ca2+和舒张功能正常。
图2Ca2+处理的HCMiPSC-CMs的舒张功能障碍
3、CRISPR/Cas9基因编辑iPSC-CMs证实TNNT2R92W突变对舒张功能障碍的致病性为了证实观察到的DD表型肌节突变的致病性，研究员接下来用CRISPR/Cas9基因编辑产生了TNNT2R92W突变的同基因对照组和病变iPSC系。18项功能试验表明，杂合子和纯合子突变引入均导致舒张期[Ca2+]i升高和[Ca2+]i瞬时衰减时间延长。而且，携带突变的同基因iPSC-CMs表现出舒张期肌节长度较短，松弛较慢，松弛时间延长。另一方面，与病变细胞相比，突变校正的患者iPSC-CMs显示出舒张期[Ca2+]i稳态和舒张功能改善。总之，这些结果证实TNNT2R92WHCM突变是致病性的，并在iPSC-CM模型中引起DD。
4、牵引力显微镜显示HCM-iPSC-CMs舒张功能障碍风险增加
为了评估舒张期[Ca2+]i升高如何影响HCMiPSC-CMs的舒张，研究员结合牵引力显微镜(TFM)和[Ca2+]i记录同时评估Ca2+处理和收缩性。发现HCMiPSC-CMs同时表现出舒张期[Ca2+]i升高和肌丝Ca2+敏感性增强，这两者均导致舒张期张力增加和松弛受损，TFM测量中HCMiPSC-CMs的松弛持续时间延长反映了这一点。
图3TFM显示HCMiPSC-CMs舒张功能障碍的风险增加
5、短期β-肾上腺素刺激会加重HCMiPSC-CMs舒张功能障碍
β-肾上腺素是正常心脏中最重要的松弛调节信号。为了评价β-肾上腺素能受体激活在舒张功能调节中的作用，研究人员测量了对照组和HCMiPSC-CMs对β-激动剂异丙肾上腺素（ISO）治疗的反应功能。结果表明，在HCMiPSC-CMs中，短期的β-肾上腺素会增加舒张功能障碍。
图4β-激动剂异丙肾上腺素（ISO）治疗的反应
6、Ca2+通道阻断剂（ICa）和动作电位晚期Na+电流阻滞剂（INaL）可使[Ca2+]i平衡，恢复心脏舒张功能
Ca2+通道阻断剂对患有DD的HCM患者有帮助。此外，INaL可改善心衰患者DD动物模型的舒张功能。然而，其对DD的治疗作用尚不明确。为了更好的理解这些药物的治疗机制，我们用Ca2+阻断剂（维拉帕米和地尔硫卓）和INaL（雷诺嗪和eleclazine）治疗HCMiPSC-CMs。结果显示，在HCMiPSC-CMs中，这些药物治疗，恢复了舒张期[Ca2+]i和瞬时衰减时间。肌节缩短测量结果也证实，ICa和INaL可部分恢复HCMiPSC-CMs的舒张期肌节长度，增加松弛率，缩短松弛持续时间。
图5ICa和INaL通过重新平衡细胞中的[Ca2+]i稳态，缩短了HCMiPSC-CMs的过长的舒张时间
7、通过长期过量Ca2+处理，可改善HCMiPSC-CMs的生存能力
Ca2+稳态是心肌细胞收缩功能的关键，而Ca2+处理不当与多种心脏疾病的发病机制有关。研究表明，HCMiPSC-CMs患者的舒张期[Ca2+]i显著升高，导致基础张力增加和舒张功能受损。HCMiPSC-CMs中长期舒张期Ca2+超载的一个重要结果是CaMKIId的激活。慢性CaMKIId激活常见于心力衰竭。然而，研究已经明确证实CaMKIId激活在DD发病机制中的关键作用，它加剧Ca2+和Na+紊乱，诱导细胞凋亡，并影响转录调控。因此，在DD发病过程中，正反馈通路中的所有关键因素，包括舒张期[Ca2+]i、CaMKIId活性、INaL、TRPCs和SR渗漏增加，可能是DD的潜在治疗靶点。
图6HCMiPSC-CMs的生存能力可通过重新平衡Ca2+稳态得到改善
稿件来源：营销中心Tina
捷易原创作品，转载请注明出处
捷易医学上线啦转载请注明：http://www.galanzweibolu.com/xjbzlzj/6120.html
