原文出处
ZangH,WuW,QiL,TanW,NagarkattiP,NagarkattiM,WangX,CuiT.AutophagyInhibitionEnablesNrf2toExaggeratetheProgressionofDiabeticCardiomyopathyinMice.Diabetes.Dec;69(12):-.
研究背景
糖尿病性心肌病是一种以心肌肥厚和纤维化为特征的临床心肌疾病，早期表现为心室舒张功能障碍，晚期可发展为心室收缩功能障碍，但与高血压或冠状动脉疾病等其他已知心脏危险因素无关。糖尿病心肌病的发病机制较多且较为复杂，但氧化应激是目前公认的糖尿病心肌病的发病机制。大量研究表明，糖尿病心肌病的有效治疗需要特异性地靶向氧化应激源或内源性抗氧化防御系统，而不是非选择性清除活性氧。
核因子E2相关因子2（Nrf2）是一种转录因子，控制多个基因的表达，这些基因包括抗氧化基因，II期解毒酶，转录因子，转运体，清道夫受体，蛋白酶体和自噬降解，以及代谢相关基因。Nrf2一直被认为是抗氧化防御的主要调节因子，并且已经发展成为一个有前景的药物靶点，用于治疗与氧化应激相关的疾病，如糖尿病性心肌病。然而，现有文献中关于Nrf2在糖尿病和糖尿病并发症中的作用一直存在很大争议。有研究发现，通过敲低Nrf2的内源性抑制剂Keap1可激活Nrf2，从而抑制db/db小鼠糖尿病的发病，但却促进了ob/ob小鼠的胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良。然而，目前我们对造成这些差异的确切原因尚不清楚。
自噬是一种在进化上高度保守的过程，可将自身细胞细胞质内容物运送到溶酶体内降解。根据内容物进入溶酶体进行最终降解的方式，自噬可分为三种类型：大自噬，微自噬和分子伴侣介导的自噬(CAM)。全身性自噬抑制可诱导细胞过早衰老，缩短寿命；而心脏特异性自噬抑制会导致非糖尿病患者的年龄相关性心肌病和死亡。T1D和T2D糖尿病小鼠均可发生心肌自噬抑制，大多数T2D模型中可出现心脏自噬抑制；然而，T1D糖尿病模型中的心脏自噬抑制似乎取决于糖尿病环境的性质。自噬在糖尿病性心肌病，特别是与T1D相关的心肌病中的确切作用仍有待研究。
在本研究中，作者证实了心脏自噬的抑制能够激活Nrf2介导的心肌细胞铁死亡从而促进T1D相关的心肌病的进展。
研究结果
结果一：心脏Nrf2介导了T1D心肌病的进展
为探究Nrf2在糖尿病心肌病中的作用，作者在给成年雄性和雌性WT和Nrf2KO小鼠进行STZ注射后的第0，1，3，6，9个月时对小鼠的一般状况和心功能进行检测。结果发现：1、与WT小鼠相比，Nrf2-KO小鼠发生心脏相关的死亡增加，而在存活的小鼠中，Nrf2KO可显著改善糖尿病小鼠增加的空腹血糖水平和体重（图1A）；2、Nrf2KO并不影响小鼠心功能紊乱的发生，但可减缓其恶性进展过程（图1C）。此外，在糖尿病中期（6个月）和后期阶段（9个月），Nrf2KO可改善糖尿病引起的心肌肥厚，心肌细胞死亡、纤维化和氧化应激，但在糖尿病阶段（0-3个月）无作用。通过测定小鼠的FS(%),BW和心脏重量与胫骨长度之比，作者发现，Nrf2能够发挥抑制T1D的发生及其相关死亡的作用，然而，它并不能阻止或推迟T1D相关的心肌病的进展，相反还可促进其进展。在分子机制层面，Nrf2可能通过增加糖尿病小鼠心脏内氧化应激水平促进糖尿病心肌病的进展。
结果二：在T1D中心脏自噬受到抑制
到目前为止，T1D相关的心肌病中心肌细胞自噬抑制的关键机制和确切作用尚不十分清楚。作者在STZ诱导的T1D小鼠体内对心肌细胞自噬流展开了时间连续性研究，以更好地监测心肌细胞自噬状态。此外，作者还在体外环境下利用高糖和/或高脂处理H9C2细胞，来分别模拟糖毒性、脂毒性和糖脂毒性，观察其对心肌细胞自噬的影响。最后，作者探究了在体内环境下敲除Atg5对心肌内自噬抑制的影响。
在糖尿病发病后的第3个月时，小鼠心脏自噬处于正常状态，而在第6个月时被显著抑制（图3A），并伴随小鼠体内甘油三酯和胆固醇的大量积累（补充表3）。在体外模型中，作者在H9C2心肌样细胞内转入mCherry-Gfp-Lc3报告基因以定量检测自噬体流和自噬溶酶体流（图3B）。实验原理为:自噬体内腔pH值约为7，而溶酶体pH值约为4，自噬体与溶酶体融合后，腔室内pH降为4。利用GFP在酸性环境中淬灭、mCherry则可以稳定发光的特点，来观察细胞自噬体的成熟或自噬流的变化。自噬溶酶体被红色荧光单独标记，自噬体被黄色荧光标记(红色和绿色荧光共同标记)。在24小时无血清正常培养基条件下，H9C2细胞基础的自噬状态表现为较多的自噬溶酶体和较少的自噬体（图3B），说明在H9C2细胞内自噬体与溶酶体源源不断地融合，形成自噬溶酶体进行自噬降解。接下来，作者使用溶酶体抑制剂BafA1来改变自噬状态，以区分与溶酶体融合的自噬体数量，即自噬体通量，以及自噬体与溶酶体融合被降解的数量，即自噬溶酶体降解或自噬溶酶外向通量。作者还发现，过量的棕榈酸酯而非高浓度葡萄糖可抑制自噬，且高糖环境可恶化脂质过载诱导的自噬抑制（图3B）。以上结果表明，脂毒性或糖脂毒性，而非单独的糖毒性可诱导自噬抑制，且糖脂毒性对心肌细胞自噬抑制的诱导作用最为明显。
随后，作者构建了CR-Atg5KO小鼠，并通过STZ注射将其诱导为T1D心肌病，并用Cre小鼠作为对照，以观察Atg5敲除对心脏自噬的影响。作者发现，Atg5敲除对糖尿病小鼠的体重、空腹血糖水平和葡糖糖耐受并无明显影响。但Atg5敲除可引起T1D小鼠发生早期心功能障碍，并促进其进展（图4A、C）。此外，Atg5敲除还可显著促进糖尿病诱导的心脏病理变化，包括心肌纤维化、心肌肥厚、心肌细胞死亡和氧化应激（图4B-C）。在体外水平，Atg5敲低可加速正常或高糖条件下H9C2细胞的死亡，而对高脂或高脂加高糖环境下H9C2细胞的死亡无促进作用（图4D），说明心肌细胞内的脂毒性和或糖脂毒性是促进自噬抑制的重要机制。以上结果表明，T1D诱导的糖脂毒性可通过心肌自噬抑制引起心肌细胞死亡从而促进糖尿病心肌病的发病。
补充表3
图4
结果三：心脏自噬抑制是驱动Nrf2介导的TID心肌损伤的关键因素
考虑到Nrf2介导的心功能障碍的发生时间与T1D中心肌细胞自噬抑制的发生时间一致（图1C、3A、4A），心脏自噬抑制可加速糖尿病心肌病的进展（图4A-C），且有研究报道心脏自噬抑制可促进Nrf2介导的心脏压力超载引起的心肌损伤，因此，作者推测心脏自噬抑制可能是驱动Nrf2介导的T1D心肌病中心肌损伤的关键因素。作者利用CR-Atg5KO小鼠模型观察Atg5敲除能否促进Nrf2介导的T1D心肌病的进展。结果发现，在糖尿病发生后的6个月时，Atg5敲除可增强Nrf2诱导的心脏病理重构和心功能障碍（图5），且敲除Nrf2可改善上述病理改变（图5）。以上结果提示“心脏自噬抑制—Nrf2激活—T1D心脏损伤和心功能障碍”轴可能在T1D心肌病中发挥重要作用。
结果四：慢性T1D可通过激活Nrf2诱导心肌细胞发生铁死亡
有研究表明，Nrf2可通过上调HO-1参与阿霉素诱导的心肌细胞铁死亡（一种依赖铁离子调节细胞死亡的形式，通过脂质过氧化物的积累而发生）。还有研究发现，心肌缺血-再灌注损伤可促进T1D中心肌细胞死于铁死亡。因此，作者想进一步探究在T1D中Nrf2能否介导铁死亡。作者发现，在糖尿病发生后的第9个月，小鼠心脏铁离子沉积增加，且Atg5敲除可进一步促进铁离子的沉积，而Nrf2敲除可改善上述情况（图6A-B）。心肌细胞内4HNE（铁死亡中脂质过氧化的标志物）的变化与铁离子变化一致，说明在T1D中，Nrf2可能通过诱导铁离子的沉积和脂质过氧化来促进心肌细胞铁死亡。事实上，敲低Nrf2可选择性抑制心肌细胞的糖脂毒性，而当使用铁死亡抑制剂（Fer-1）和铁离子螯合剂（DFO）时也可改善H9C2细胞内的糖脂毒性（图6C-E）。说明在T1D后期阶段发生的糖脂毒性可驱动Nrf2介导的心肌细胞铁死亡。至此，作者阐明了“慢性T1D—心肌细胞自噬抑制—Nrf2激活—心肌细胞铁死亡”轴。
为进一步证明Nrf2介导的心肌细胞内铁死亡，作者用erastin（铁死亡激动剂）处理H9C2细胞，以观察Nrf2在铁死亡过程中的作用。结果发现，erastin处理可上调H9C2细胞内Nrf2及其下游靶基因NAD（P）H，Nqo1,Cd36，Agt和Klf9的表达（补充图21B）。此外，作者还探究了Nrf2敲低对H9C2细胞铁死亡的影响。在正常葡萄糖水平和自噬状态下，敲低Nrf2可轻微增加H9C2细胞死亡（图7A-B），说明在正常自噬条件下，Nrf2可发挥心肌细胞保护性作用。但敲低Nrf2可显著改善erastin诱导的铁死亡并降低RSL3（GPX4抑制剂，诱导铁死亡）的表达（图7A-B）。此外，Nrf2的敲低还可抑制基础的和erastin诱导的Acsl4的表达，逆转erastin诱导的Fsp1的表达抑制，同时上调其基础表达水平（图7C）。这些结果表明，在心肌细胞中，Nrf2在抑制Fsp1的同时驱动Acsl4的表达，而GPX4失活导致的铁死亡可能会加强这一现象。
以上结果表明，T1D诱导的自噬抑制可促进Nrf2介导的心肌细胞铁死亡，从而促进糖尿病心肌病的进展。
图7
补充图21
结果五：在自噬受损的糖尿病心脏中，Nrf2驱动的防御作用被削弱，而其参与调节的病理信号被激活
为探究在T1D中敲除Nrf2所观察到的现象是Nrf2的心脏特异性作用还是Nrf2全身敲除的代偿性反应，研究者构建了心脏特异性过表达Nrf2的小鼠（CR-Nrf2过表达），并通过STZ注射将其诱导为T1D。结果发现，CR-Nrf2过表达小鼠在糖尿病发生的第5个月可出现心功能障碍，这与对照NG小鼠一致，但在7个月时可显著加速小鼠心功能障碍，且伴随死亡率的增加（图8A）。心脏特异性过表达Nrf2可增强糖尿病诱导的心肌纤维化、氧化应激和心肌细胞凋亡，其中氧化应激的增强是过表达Nrf2最为显著的作用（补充图22E-H）。这些结果表明，激活心脏Nrf2可能并不有益；相反，它可能通过增加心脏氧化应激的机制对糖尿病心脏有害，从而促进糖尿病心肌病的进展。为进一步探讨T1D诱导的心肌病中心肌自噬抑制与Nrf2不良活化之间的关系，作者检测了CR-Nrf2过表达对STZ诱导的T1D小鼠心肌自噬抑制状态及自噬相关基因表达下调的影响。结果发现，CR-Nrf2过表达几乎不影响自噬抑制，并及其轻微地下调了一些自噬基因，包括Atg5、Atg7、Atg12、Atg16l1、Rab7、Rab9和溶酶体相关膜蛋白1(Lamp1)(补充图23)。以上结果表明，心脏Nrf2的恶性激活很可能是继发于T1D的心肌自噬抑制。
随后，为进一步探究自噬受损的H9C2细胞中Nrf2调节的铁死亡信号是否参与STZ诱导的小鼠T1D心肌病发病机制，作者用STZ诱导FVB/N小鼠发生T1D，检测小鼠心脏内铁死亡基因的表达模式，Nrf2及其靶基因的表达情况。结果发现，在糖尿病发生后的第3个月时，小鼠心脏自噬处于正常状态，此时铁死亡相关标记物Cox2和Chac1表达上调，而铁死亡一致基因Gpx4和Fsp1表达下调(补充图24A)，表明可能会发生心脏铁死亡。此外，Nrf2及其靶基因表达上调，包括抗氧化剂Nqo1和Ho-1、Cd36、Agt和Klf9的表达均上调。然而，Nrf2促进心脏保护性Fgf21表达的功能也在糖尿病心脏中保留(补充图24C-D)。以上结果表明，Nrf2信号在糖尿病心脏中被完全激活，而保存的心脏功能可能反映了正常自噬状态下糖尿病心脏中Nrf2驱动的细胞防御和Nrf2参与的损伤程序之间的平衡。在糖尿病发生后的第6个月时，心脏自噬被抑制，铁死亡相关的起始基因Acsl4的表达显著增加(补充图24)，说明在自噬受损的糖尿病心脏中铁死亡增加。随后，作者在STZ诱导的T1D小鼠发病7个月后，检测了小鼠心脏脂质过氧化和铁离子沉积，及铁死亡相关标志物Cox2和Chac1、铁死亡抑制剂Gpx4和Fsp1以及铁死亡起始基因Acsl4的表达。结果发现，在心功能障碍和自噬抑制的糖尿病小鼠心脏中(图3A和8A)中，CR-Nrf2过表达增强了脂质过氧化(4HNE表达增加)、铁离子沉积以及Cox2、Chac1和Acsl4的表达，同时抑制了Gpx4和Fsp1(图8B-D)的表达。以上结果支持了自噬抑制激活Nrf2以促进慢性糖尿病心脏心肌细胞铁死亡的观点(图8E)。
补充图22
补充图23
补充图24
研究结论
1、随时间进展，糖尿病可导致自噬受损，使Nrf2介导的保护性作用转变为促进心肌细胞铁死亡，从而恶化糖尿病心肌病
2、慢性T1D诱导的糖脂毒性可导致自噬抑制，从而促进Nrf2介导的脂质过氧化相关分子的转录，削弱Nrf2介导的抗氧化防御作用，破坏Nrf2协调的铁离子代谢，导致心肌细胞铁死亡
校对：魏金龙
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