摘要：感染性心肌病与线粒体损伤和内质网功能障碍有关。然而线粒体损伤和ER应激的上游介质尚未被确定，因此治疗脓毒性心肌病的药物很少。在此探讨B细胞受体相关蛋白31(BAP31)在脓毒症心肌病中的作用，并探讨褪黑素是否能通过调节BAP31减轻脓毒症介导的心肌抑郁。采用脂多糖(LPS)建立脓毒性心肌病模型。通过westernblot、q-pcr和免疫荧光等方法进行通路分析。通过酶联免疫吸附试验、Westernblot和免疫荧光检测线粒体功能和ER应激。暴露于LPS后，由于过度的炎症反应和广泛的心肌细胞死亡，心功能下降。褪黑素治疗可以通过保持线粒体功能和减少ER应激而剂量依赖性地提高心肌细胞的活力。BAP31转录受到LPS的抑制，而褪黑素则能恢复BAP31的表达，这一效应依赖于MAPK-ERK通路。抑制ERK通路或敲除BAP31可减轻LPS应激下褪黑素对线粒体功能和ER稳态的有益影响。总之，结果表明ERK-BAP31通路可作为脓毒症相关心肌损伤线粒体功能和ER稳态的关键介质。褪黑素可通过ERK途径稳定BAP31，从而有助于保护脓毒症心肌病的心功能。
一．实验方法
1.caspase3活性测定
用caspase3比色测定试剂盒测定C3的活性。将5μl匀浆加入96孔聚苯乙烯板中，与85μlcaspase三种底物和10μlAc-DEVD-pNA混合。混合物在37°C下孵育，nm处的吸光度监测30分钟。
2.Westernblot分析
转染后48小时，用RIPA裂解缓冲液溶解组织或细胞，并获得总蛋白。采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩分离等量蛋白质。然后将总蛋白转移到聚偏氟乙烯膜。4°C初级抗体过夜探测，然后与二次抗体孵育。使用ECLWesternblot分析试剂盒对所有蛋白带进行可视化。
3.从肾组织中分离RNA和QRT-PCR
用TRIzol试剂提取总RNA，然后用分光光度计测定RNA的浓度和纯度。用QuantiTect?反向转录试剂盒反转录一微克RNA用于cDNA合成。用快速SYBR绿色主混合物(CATNO)对靶基因进行定量实时聚合酶链反应(QRT-PCR）。
4.CCK-8测定
将μl细胞悬液放入96孔板中，在37°C和5%CO2的加湿孵化器中预孵育24小时。随后，用质粒转染细胞。用10%木炭剥离FBS在MEM中孵育5h后，用不同的药物或LPS代替培养基。在不同时间（转染后0、24、48、72、96和小时)测定细胞活性。然后，加入10μlCCK-8溶液，孵育2h用全自动定量绘图酶标仪测量nm处的吸光度。
5.流式细胞仪测定ROS含量
用药物治疗后，用冷0.01MPBS洗涤细胞三次。然后将细胞重新悬浮在结合缓冲液中，在37°C下用10μMDHE(1：0，游离FBS培养基)处理20分钟。用流式细胞仪检测ROS。
6.TUNEL法检测凋亡细胞
用TUNEL试剂盒测定细胞凋亡，并根据DNA链断裂标记定量凋亡。细胞样品在室温下用4%多聚甲醛固定20-30min，用PBS冲洗三次(每次5min)。随后将切片装入毫升1%TritonX-溶液中3-5分钟，用PBS冲洗三次，然后将切片浸泡在3%的H2O2中，并在TDT酶后使用5μl链霉亲和素-FITC标记溶液反应。在荧光显微镜下，用~nm激发波长和~nm检测细胞。此外，用过氧化物酶结合抗FITC和二氨基联苯胺底物进行信号转换。最后用荧光显微镜获得图像。
7.线粒体膜电位测量
线粒体电位用JC-1探针测量。细胞用药物治疗后，用JC-1工作溶液nm，在37°C的黑暗中更换培养基，细胞染色20分钟。随后JC-1工作溶液被移除。然后用正常培养基洗涤细胞两次，每次10min。最后用荧光显微镜获得图像。
8.炎症因子的酶联免疫吸附试验
使用ELISA)试剂盒。在nm处检测各组的光密度(OD)值。
二．实验结果
1.LPS介导的感染性心肌病在体内被褪黑素减弱
通过ELISA测定炎症因子水平。LPS治疗可增加肿瘤坏死因子α、白介素-6和MCP1的水平。而褪黑素可以剂量依赖性地降低炎症因子的水平。暴露于LPS治疗后，LDH、CK-MB和TNT等心脏损伤标志物的水平也明显升高，褪黑素可减轻这些改变。
使用TUNEL染色来估计凋亡心肌细胞的数量。LPS治疗增加了凋亡心肌细胞的比率，褪黑素治疗可逆转这种改变。暴露于LPS后，caspase-3活性迅速升高。褪黑素治疗显著抑制caspase-3的激活。表明：褪黑素治疗改善了LPS在体内诱导的脓毒性心肌病。
2.褪黑素降低LPS应激下的ER应激和线粒体损伤
JC-1染色表明，暴露于LPS应激后，线粒体电位降低。褪黑素治疗可提高线粒体电位，如绿色荧光减少和红色荧光增加。此外，DCFH-DA探针在LPS处理的心肌细胞中显示ROS超载。然而，褪黑素治疗以剂量依赖性的方式抑制ROS的过度产生。细胞抗氧化剂的含量在LPS胁迫下降低。褪黑素治疗逆转了LPS应激下细胞抗氧化剂的活性。
LPS治疗通过免疫荧光染色增加了ER应激的标记物；褪黑素治疗可抑制其作用。ER应激可激活capase-12。LPS治疗提高了caspase-12的水平，而褪黑素治疗显著降低了caspase-12的活性。表明：LPS诱导的ER应激和线粒体损伤可以通过褪黑素来改善。
3.褪黑素通过ERK途径上调BAP31
BAP31已被发现与ER功能和线粒体稳态有关。Westernblot分析表明，LPS逐渐抑制BAP31，而褪黑素治疗可剂量依赖性地增加LPS处理的心肌细胞中BAP31的水平。LPS也抑制了BAP31的转录，并通过褪黑素处理将其逆转为接近正常水平。BAP31与ERK通路之间存在着密切的关系。在褪黑素处理的心肌细胞中加入ERK抑制剂测定BAP31的转录。与LPS组相比，褪黑素逆转了心肌细胞BAP31的转录，ERK抑制剂消除了这种促进作用。随后进行BAP31免疫荧光法观察BAP31在蛋白质水平上的改变。LPS显著降低了BAP31的水平，褪黑素可逆转这一作用。ERK抑制可损害褪黑素介导的BAP31上调，提示褪黑素通过ERK途径控制BAP31的表达。
4.敲除BAP31或抑制ERK可消除心肌细胞褪黑素相关保护
为了了解ERK/BAP31通路是否参与褪黑素介导的LPS处理的心肌细胞保护，在BAP31和ERK拮抗剂中加入小干扰RNA褪黑素处理的心肌细胞。随后采用MTT法和乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定心肌细胞活力。LPS处理后心肌细胞活力降低。虽然褪黑素可以逆转LPS应激下心肌细胞的存活，但一旦BAP31基因敲除，这种生存效应就会减弱或抑制ERK通路。此外，LDH的释放还表明褪黑素通过ERK-BAP31途径降低心肌细胞培养基中LDH的含量。用westernblot分析评价caspase-3的改变。caspase-3活性被LPS应激激活，褪黑素减少。TUNEL染色还表明，LPS治疗后凋亡心肌细胞数量增加。虽然褪黑素可以降低凋亡心肌细胞的比例，但在抑制ERK-BAP31通路后，促存活效应受损。一旦阻断ERK-BAP31通路，褪黑素对caspase-3的调节作用就会中断。表明：ERK-BAP31通路是褪黑素介导的LPS应激下心脏保护所必需的。
5.褪黑素通过ERK/BAP31途径调节ER应激和线粒体损伤
线粒体电位分析表明，LPS介导的线粒体电位降低可被褪黑素逆转，一旦阻断ERK-BAP31通路，这种效应就无效。除了线粒体电位外，通过流式细胞术测定的细胞活性氧(ROS)通过LPS应激显著升高。褪黑素治疗可减轻ROS超载，这一效应取决于ERK-BAP31轴。表明：褪黑素通过ERK-BAP31途径维持线粒体功能。
LPS处理后ER应激标志物水平迅速上调。褪黑素治疗可减轻ER应激相关蛋白，一旦抑制ERK或沉默BAP31，这种效应就无效。同样，caspase-12的活性被LPS增强，并降低到接近正常水平的褪黑素治疗。褪黑素介导的caspase-12一旦阻断ERK-BAP31通路，就会被抑制。表明：褪黑素通过ERK-BAP31途径纠正ER应激和线粒体损伤。
三．讨论
褪黑素治疗可减轻LPS攻击后的心肌损伤，改善心功能。显著逆转ERK通路的活性，促进BAP31的上调，LPS明显抑制BAP31。此外，BAP31的增加与线粒体功能的改善有关，如线粒体电位较高和ROS产生较低。BAP31还能减轻ER应激，抑制caspase-12的激活。褪黑素治疗可显著提高心肌细胞活力，减少LPS介导的心肌细胞死亡。这些结果表明，线粒体损伤和ER应激都参与了脓毒症心肌病的进展。此外，BAP31似乎是LPS应激下线粒体损伤和ER应激的上游调节因子。重要的是，褪黑素可以逆转BAP31的表达，从而减轻线粒体损伤和ER功能障碍，最终保护心脏免受脓毒症的影响。线粒体或ER都是由BAP31调制的。在此，研究进一步阐明BAP31可以同时影响线粒体稳态和ER功能。ERK通路控制BAP31的转录。抑制ERK通路可消除褪黑素介导的BAP31上调。在褪黑素处理下，ERK控制BAP31转录的过程。总之，结果表明线粒体损伤和ER应激参与了脓毒症心肌病的进展。褪黑素补充可通过抑制线粒体损伤和ER功能障碍来改善心脏性能，其机制与ERK-BAP31通路有关。
预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇转载请注明：http://www.galanzweibolu.com/xjbzlzj/7651.html
